40-летний Эцио Аудиторе да Фиренце поднялся на вершины иерархии ордена после окончания событий игры Assassin's Creed II.^[15] Отомстив убийцам отца и братьев, он покинул Рим и наслаждается жизнью на своей вилле. Действие игры начинается в 1499 году, когда Эцио после разговора с Минервой бежит из Рима вместе со своим дядей Марио Аудиторе. После, фамильная резиденция рода Аудиторе — Монтериджони (итал. Monteriggioni) осаждена наёмниками семьи Борджиа. Осаду проводит сын РодригоЧезаре Борджиа. В осаде, на глазах у Эцио, погибает его родной дядя Марио.^[16] После этого действие игры переносится в 1500 год, где Эцио вынужден организовать и начать развивать «подполье» (в которое входят Римские воры, куртизанки, а далее и рекруты-ассасины), когда начинает возрождаться орден, лидером которого формально был Николло Макиавелли, который после передаст титул Эцио. На протяжении игры Эцио пытается найти убийц своих родственников и отомстить им, а также вернуть Риму былой мир, порядок и процветание.

В будущем Дезмонд, Люси, Шон и Ребекка прибывают в Монтериджони. Они должны пройти подземные туннели и устроить укрытие в Святилище под виллой Аудиторе для того, чтобы найти Яблоко Эдема и остановить надвигающуюся катастрофу. Из воспоминаний Эцио становится ясно, что тот спрятал яблоко Эдема под Колизеем в Риме. Команда отправляется туда, чтобы забрать яблоко, они проходят катакомбы, и находят искомое. Как только Дезмонд взял в руки яблоко, оно овладело им и заставило ударить Люси скрытым клинком в область живота (неизвестно, жива ли Люси или нет). Оба они падают без сознания. После, два неизвестных находят героев и подключают Дезмонда к «Анимусу», так как тот был в состоянии сильнейшего шока, а спасти его можно было только так. В конце дополнения «The Da Vinci Disappearance» из разговора незнакомцев становится ясно, что одного из них зовут Уильям (вероятно, тот, с которым переписывалась Люси), а Дезмонд впал в кому.