Современные персонажи:

• Дезмонд Майлс — главный герой всей серии игры, ассасин, бывший бармен, потомок Эцио и Альтаира.
• Люси Стиллман — ассасин, обучает Дезмонда навыкам ассасина.
• Ребекка Крейн — инженер, построила и улучшила Анимус 2.0.
• Шон Гастингс — историк, наводит Дезмонду сведения о персонажах, неуклюжий и нервный циник.
• Уоррен Видик — учёный, тренер агентов Абстерго (появляется только в мультиплеере).

Исторические персонажи:

• Эцио Аудиторе да Фиренце — главный герой игры, ассасин.
• Марио Аудиторе — дядя Эцио, ассасин.
• Клаудия Аудиторе — сестра Эцио, ассасин.
• Мария Аудиторе — мать Эцио.
• Кристина Веспуччи — возлюбленная Эцио, появляется в воспоминаниях Эцио о ней. Погибает в воспоминании Бесплодные усилия любви.
• Ла Вольпе — друг Эцио, профессиональный вор, ассасин.
• Никколо Макиавелли — друг Эцио, наставник ассасинов.
• Бартоломео д'Альвиано — друг Эцио, воин, ассасин.
• Пантасилея Бальони — жена Бартоломео.
• Леонардо Да Винчи — друг Эцио, художник, изобретатель. Создал парашют для Эцио, а также вернул ему всё потерянное снаряжение.
• Катерина Сфорца — графиня Форли, любовница Эцио, просит у наёмников помощи в обороне Форли.
• Октавиан де Валуа — барон, французский полководец. Противостоит ассасинам. Захватил в заложники Пантасилею Бальони, вследствие чего убит Эцио Аудиторе.
• Фабио Орсини — кондотьер римской армии, двоюродный брат Бартоломео д'Альвиано, ассасин.
• Микелетто Корелья — профессиональный убийца, соратник Чезаре Борджиа.
• Пьетро Росси — актер, любовник Лукреции Борджиа. Был тяжело ранен вследствие заговора, организованного Микелетто Корелья и Чезаре Борджиа.
• Родриго Борджиа — папа римский, тамплиер, убит Чезаре Борджиа.
• Чезаре Борджиа — сын Родриго Борджиа, капитан — генерал папской армии. Атаковал фамильную виллу Аудиторе, убил Марио Аудиторе, украл яблоко Эдема и захватил в плен Катерину Сфорца. На протяжении всей игры является главным антагонистом игры. Убит Эцио Аудиторе.
• Лукреция Борджиа — дочь Родриго, сводная сестра и, по совместительству, любовница Чезаре. В дополнении «Исчезновение Да Винчи» является герцогиней.
• Эгидио Троке — сенатор, брат Франческо Троке.
• Франческо Троке — камерарий и секретарь папы римского, брат Эгидио Троке.
• Федерико Аудиторе — брат Эцио. Появляется в воспоминании о Кристине.
• Вьери Пацци — сын банкира. Появляется в воспоминании Эцио о Кристине.
• Салаи — ученик Леонардо Да Винчи.
• Эрколе Массимо — лидер герметистов.