• Альтаир ибн Ла-Ахад — главное действующее лицо игры. Высококлассный боец, один из лучших представителей своего ордена, упрямый и своенравный по своему характеру. Авторитет среди ассасинов и гроза любого стража порядка. Провинившись на важном задании, когда он нарушил три основных пункта кодекса ассасинов, был разжалован до новичка. В течение всей игры выполняет приказы главы ордена ассасинов Аль-Муалима, параллельно пытаясь понять его тайные мотивы.
• Аль-Муалим — Мастер ордена ассасинов, учитель Альтаира. Недолюбливает Альтаира за свободолюбие и неуважение к кодексу, но ценит за талант и мастерство. Управляет подчиненными в личных целях, прикрываясь стремлением к миру на Священной палестинской земле. Ассасины боготворят наставника и готовы мгновенно исполнить любое его приказание.

Альтаиру предстоит, согласно сюжетной линии, ликвидировать 9 важных людей в 3 городах (Дамаске, Акре и Иерусалиме), во главе которого стоит Робер де Сабле:

• Робер де Сабле — Магистр тамплиеров, умелый дипломат и полководец, его действия повлияли на исход третьего крестового похода. После серии смертей сторонников объявил ассасинов своими злейшими врагами и пытался объединиться с сарацинами в борьбе против их братства.
• Тамир — Богатый и влиятельный купец из Дамаска, нелегально поставляющий оружие крестоносцам. Жестокий и беспринципный человек, первая жертва Альтаира по указанию Аль-Муалима.
• Талал — Процветающий работорговец, ведущий свои дела в Иерусалиме. Меткий лучник, хитрый, но трусливый человек, любящий поиграть с жертвой перед расправой.
• Гарнье де Наплуз — Доктор-маньяк из Акры, ставящий жестокие эксперименты над своими пациентами. Ранее вел свои дела во Франции, но во время третьего крестового похода перебрался в Акру, продолжив здесь свою деятельность.
• Абу-аль-Нуквод (король-купец) — Богатейший торговец Дамаска, ненавидящий бедняков и олицетворяющий для горожан нравственное разложение.
• Мажд-Аддин — Жестокий и беспринципный правитель Иерусалима, любитель массовых казней. С его подачи начались массовые гонения на религиозной почве.
• Уильям Монферрат — Регент Акры, известный тем, что казнил однажды три тысячи сарацинов. Готовил заговор против короля Ричарда Львиное Сердце.
• Джубаир-аль-Хаким — Учёный из Дамаска, ярый борец против просвещения. Собирает и уничтожает всевозможные рукописи, жестоко расправляясь по ходу дела с несогласными.
• Сибранд — Командуя флотом Тевтонского ордена, он очень боялся покушений и постоянно подозревал свое окружение в предательстве. Поэтому, Сибранд не покидает своего корабля, надеясь, что в море убийцы его не достанут.