Действие игры одновременно разворачивается в недалёком будущем и в прошлом, во время Третьего крестового похода (1191 год). В будущем времени героем является Дезмонд Майлс, обычный бармен, который был похищен корпорацией «Абстерго Индастриз» (с лат. очистка, зачистка) для получения важной информации. Очнувшись, герой обнаруживает себя лежащим в странном устройстве в лаборатории. В курс дела его вводят двое ученых: Люси Стиллман и Уоррен Видик. Дело в том, что он является последним из древнего рода убийц, служивших в Братстве ассасинов. В частности, одним из его предков был убийца по имени Альтаир ибн Ла-Ахад (от арабского «ан-наср ат-таир» (араб. النسر الطائر‎‎), означающего «летящий орёл»), который и является героем действия в прошлом. Люси и Видик с помощью аппарата «Анимус» (лат. anima — душа) декодируют генетическую память Дезмонда, которая, по словам Уоррена, содержит воспоминания о действиях его предков. Молодому бармену приходится раз за разом переживать приключения своего дальнего родственника.

Альтаир — убийца, один из лучших во всём Братстве Ассасинов. Поэтому ему поручено вместе с двумя напарниками найти гробницу в районе Иерусалима и добыть из неё некий важный артефакт. В этой гробнице Альтаир встречается лицом к лицу сКрестоносцами, которые также разыскивают ценность. Он решает, что это отличный шанс уничтожить Робера де Сабле, гроссмейстера Тамплиеров. Проявив самонадеянность, ассасин проваливает задание и подставляет под удар своих напарников. Ему приходится вернуться в Масиаф ни с чем, сообщив главе ордена Аль-Муалиму (с арабского Учитель (Наставник)) о своей неудаче. Но случилось так, что один из напарников Альтаира, Малик, выжил, потеряв руку и брата, и вернулся в замок. Более того, он принёс с собой искомую реликвию — «Частицу Эдема». Во время их разговора на Масиаф нападает Орден Тамплиеров, и хотя Альтаир помог ассасинам отбиться, его обвинили во всех жертвах этого нападения и нарушении трёх основных принципов братства, главный из которых — не подставлять под угрозу братство. Аль-Муалим разыграл казнь Альтаира.

Придя в себя, наш герой узнаёт, что он вовсе не мёртв. Однако он был понижен в ранге и уровень доверия к нему упал. Чтобы восстановить свою репутацию в глазах Братства и обрести «мир в себе», Альтаир должен убить девятерых важных людей в трёх городах: Дамаске, Акре и Иерусалиме.

Убивая одну цель за другой, Альтаир постепенно выясняет, что его жертвы связаны между собой. Каждый из девяти человек перед смертью раскрывал часть плана тамплиеров. Убив последнюю жертву, наш герой отправляется в Масиаф. Там он понимает, что Аль-Муалим предал орден ассасинов и использовал частицу Эдема для подчинения жителей. Альтаиру предстоит убить предателя, после чего он намеревается уничтожить артефакт, но принимает решение оставить его себе с целью использовать на благо.