Современные персонажи

• Дезмонд Майлс (кодовое имя «Объект 17») — потомок Эцио и Альтаира. До шестнадцати лет учился умениям ассасина, но после сбежал. До похищения работниками «Абстерго» работал барменом и жил под фальшивыми именами, чтобы его труднее было отыскать. После побега с Люси согласился обучиться навыкам ассасинов, чтобы отомстить корпорации.
• Люси Стиллман — агент ассасинов. Некоторое время работала в «Абстерго» над «Анимусом». Винит себя в смерти «Объекта 16».
• Ребекка Крэйн — технический специалист ассасинов, создавшая новую, улучшенную версию «Анимуса».
• Шон Гастингс — координатор, отвечающий за базы данных и снабжающий Дезмонда необходимой информацией.
• Майкл (кодовое имя «Объект 16») — ассасин, его похитило Абcтерго ещё до Дезмонда. В Абстерго сделал много знаков с помощью крови, и в программу Анимуса тоже внёс знаки, чтобы Объект 17 (Дезмонд) разгадал тайну. Во второй части истина была в видео про Адама и Еву, в Братстве Крови он сам появляется (точнее силуэт). Люси утверждает, что он умер, однако сам он говорит что ещё живой.
• Уоррен Видик — тамплиер, сотрудник корпорации «Абстерго Индастриз», под руководством которого Дезмонд реконструировал воспоминания Альтаира. В конце второй части игры отыскивает убежище Дезмонда.

Исторические персонажи

• Эцио Аудиторе — главный протагонист игры, сын флорентийского банкира Джованни Аудиторе. Как и его отец, он ассасин.
• Леонардо да Винчи — учёный , художник, инженер. Помогает Эцио в его приключениях, в частности, расшифровывая страницы кодекса, конструирует оружие и даёт «попользоваться» летучей машиной.
• Лоренцо Медичи — друг Эцио Аудиторе. После спасения своей жизни подарил Эцио плащ Медичи и страницу Кодекса.
• Родриго Борджиа — глава итальянских тамплиеров, папа римский. Борджиа стремился соединить две частицы Эдема и объединить Италию под властью тамплиеров. Именно он виновен в смерти отца Эцио Джованни и его братьев Петруччо и Федерико. Родриго Борджиа является конечной целью Эцио и главным антагонистом игры.
• Уберто Альберти — гонфалоньер Флоренции, старый друг семьи Аудиторе. Именно ему Эцио относит важное письмо, в котором содержатся доказательства непричастности к заговору семьи Аудиторе. Из-за любимой женщины предал семью Эцио и объединился с тамплиерами.
• Вьери Пацци — молодой дворянин, младший сын Франческо Пацци. Вьери склонен к расточительству и жестокости. Много раз пытался причинить вред семье Эцио. Даже его отец говорит о своем сыне как о непокорном и агрессивном человеке. Однако в своем письме к Франческо Пацци Фра Джокондо пишет, что Вьери просто необходима отцовская любовь и его еще вполне можно исправить.
• Франческо Пацци — банкир, представитель флорентийской семьи Пацци. Являлся центральной фигурой заговора против Лоренцо Медичи.
• Бернардо Барончелли — банкир, пособник тамплиеров. Принимал участие в заговоре против Лоренцо Медичи. После неудачной попытки восстания против власти Медичи во Флоренции укрылся в Тоскане.
• Антонио Маффеи — священник, участник заговора против Лоренцо Медичи. После покушения на Лоренцо скрылся в крепости Сан-Джиминьяно и вел проповеди, направленные против семьи Медичи.
• Стефано да Баньоне — священник, советник Якопо Пацци. После неудачного заговора против Медичи сбежал в аббатство недалеко от Сан-Джиминьяно.
• Франческо Сальвиати — архиепископ Пизы, мечтал занять ту же должность во Флоренции, однако Медичи не давали ему сделать это, так что Сальвиати присоединился к тамплиерам. Именно он ввел войска тамплиеров в город. После гибели Франческо Пацци поспешил укрыться в своей вилле недалеко от Сан-Джиминьяно.
• Якопо Пацци — глава семьи Пацци и семейного банка. Многократно добивался суда над Лоренцо Медичи, однако против него у Якопо ничего не было, поэтому Пацци вступил в сговор с тамплиерами в надежде покончить с правлением Медичи во Флоренции.
• Эмилио Барбариго — глава гильдии купцов, влиятельный человек в Венеции. Почти единолично финансировал венецианскую городскую стражу, установил монополию на рынке, что позволило ему быстро продвинуться по карьерной лестнице.
• Карло Гримальди — дворянин, член Совета десяти. Благодаря умению хранить тайны и угождать высшим чиновникам добился уважения среди дворян. Участвовал в заговоре против венецианского дожа Джованни Мочениго.
• Марко Барбариго — дворянин, участник заговора против Джованни Мочениго. Имеет личного телохранителя Данте Моро, женат на его бывшей супруге. В результате интриг тамплиеров стал новым дожем.
• Данте Моро — телохранитель Марко Барбариго, бывший капитан венецианской городской стражи. После покушения, подстроенного Марко, повредился в уме, что позволило Барбариго жениться на жене Моро и заставить стать его своим телохранителем.
• Сильвио Барбариго иль Росо — член Верховного трибунала Венеции, прокурор. Участник заговора против Джованни Мочениго. После гибели Марко Барбариго попытался бежать из Венеции.
• Чекко Орси — профессиональный вор, брат Людовико Орси. По приказу Родриго Борджиа напал на Форли.
• Людовико Орси — профессиональный вор, брат Чекко Орси. Вместе с Чекко напал на Форли по приказу Родриго Борджиа.
• Джироламо Савонарола — монах-доминиканец, не состоял в сговоре с Родриго Борджиа. После того, как Савонарола находит Частицу Эдема, он захватывает власть во Флоренции с помощью этого древнего артефакта.
• Катерина Сфорца — дворянка, правительница Форли. Вдова Герцога Риарио, который ранее правил в Форли. Организовала убийство своего мужа, поручив это Чекко и Людовико Орси. Помогала ассассинам (и Эцио Аудиторе в том числе) скрыть от тамплиеров Яблоко Эдема.
• Федерико Аудиторе — дворянин, старший брат Эцио. Убит из-за предательства Уберто Альберти. Погиб вместе с Петруччо и Джованни Аудиторе.